植物氧化应激活性氧超氧阴离子比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文...

 植物氧化应激活性氧超氧阴离子比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 植物氧化应激活性氧超氧阴离子比色法定量检测试剂是一种旨在通过硝基蓝四氮唑染料，受到超氧阴离子O₂^-的还原，产生不溶性蓝黑*素沉淀，由分光光度仪比色分析，定量检测样品超氧阴离子活性氧族的生成和增加的的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等）等的超氧阴离子检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O^2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H₂O₂）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，包括硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧阴离子O₂^-的直接还原，便产生不溶性蓝黑色甲暨色素，在分光光度仪下（540nm波长），呈现吸光峰值的变化。据此定量检测植物组织细胞内超氧阴离子活性氧族的浓度。  

产品内容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  20毫升

 缓冲液（Reagent C）  20毫升

 反应液（Reagent D）     2毫升

 阴性液（Reagent E）     1毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

比色皿或酶标板：用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的1毫升 裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）
• 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长540nm，并置零
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 反应液（Reagent D）避免光照
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 阴性液（Reagent E）
• 加入100微升 反应液（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照

• 样品测定

• 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 加入100微升 反应液（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、计算样品浓度

[（样品读数－背景读数）X 1 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；毫升）X 7.2（毫摩尔吸光系数）]＝微摩尔O^2-/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔O^2-/毫克

• 酶标板测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取200微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
• 分别加入25微升 阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 分别加入25微升 反应液（Reagent D）到96孔板的所有孔中
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
• 浓度计算：

[（样品读数－背景读数）X 0.25 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.025（样品容量；毫升）X 7.2（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）]＝微摩尔O^2-/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔O^2-/毫克

注意事项

• 本产品为20次（比色皿）或80次（酶标板）操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，避免光照
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要
• 测定值由低到高变化
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 如果超氧阴离子活性氧浓度过低，可以延长孵育时间至4小时
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本浓度过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 本公司提供系列活性氧检测试剂产品 

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感