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植物-淀粉酶(-AMYLASE)活性DNS比色法定量检测试剂盒产品

更新时间:2018-05-22 点击次数:1977

 植物a-淀粉酶(a-AMYLASE)活性DNS比色法定量检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 植物a-淀粉酶(a-AMYLASE)活性DNS比色法定量检测试剂是一种旨在使用具有还原力的黄色3,5-二硝基水杨酸与受到a-淀粉酶中性环境下水解产生的还原基团分子反应,生成强烈吸光的3-氨基-5-硝基水杨酸即采用比色法测定其还原后峰值的升高变化,以此测定样品中a-淀粉酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种新鲜植物组织,包括叶片(leaf)、谷粒(grain)、种子(seed)等裂解萃取液样品a-淀粉酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

 

技术背景

 

淀粉酶(AMYLASE)属于糖苷水解酶类(glycoside hydrolase)。淀粉酶通过水解方式,分解淀粉的α-1,4链接,释放出葡萄糖、麦芽糖(maltose)、麦芽三糖(maltotriose)、糊精(dextrin)等简单糖分子。淀粉酶分成三类:α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶(EC 3.2.1.1)又称为α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase)或糖原酶(glycogenase),是钙离子依赖性钙金属蛋白酶(calcium metalloenzyme),分解淀粉为葡萄糖、麦芽糖(maltose)、麦芽三糖(maltotriose)、糊精(dextrin)等,为主要的消化酶,尤其在人体中,例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶(EC 3.2.1.2),又称为α-1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶(1,4-α-D-glucan maltohydrolase)或糖基淀粉酶(saccharogen amylase),分解淀粉为葡萄糖等。植物、真菌、细菌等均能产生,而人体组织不含有。γ-淀粉酶(EC 3.2.1.2),又称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶(Glucan 1,4-α-glucosidase)或溶酶体α-葡萄糖苷酶(lysosomal α-glucosidase),在酸性环境下分解淀粉为葡萄糖。淀粉是一种复杂分子,由多聚糖直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)构成。植物和细菌产生大多数淀粉。在淀粉酶的催化作用下,分解产生简单糖分子,作为能源储存,植物用于光合作用。植物和细菌性淀粉酶常用于工业,包括烘培食物和乳制品的制造,以及酒精和纸材的生产。基于淀粉,在中性环境下,通过α-淀粉酶的水解,释放出麦芽糖等含有游离的还原性基团(例如酮基等),进一步使用具有还原力的黄色3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid;DNS)与之反应,产生红棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸(3-amino-5-nitrosalicylic acid),在分光光度仪(540nm波长)下测定,以定量分析α-淀粉酶的活性。其反应方式为:   

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A) 毫升

 裂解液(Reagent B) 毫升

 缓冲液(Reagent C) 毫升

 反应液(Reagent D) 毫升

 底物A(Reagent E) 毫升

 底物B(Reagent F 毫升

 补充液(Reagent G

 标准液(Reagent H  

产品说明书    1份

 

保存方式

 

保存在4冰箱里; 底物液B(Reagent F),避免光照,有效保证6

 

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

2.2毫升离心管:用于配制标准样品的容器

DOUNCE匀浆器:用于裂解组织

尼龙网(nylon mesh):用于去除残渣

4℃(微型)台式离心机:用于样品处理

沸水装置:用于反应物孵育

比色皿:用于比色测定的容器

分光光度仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

一、样品准备

 

  • 准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定1克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升 清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(zui快速度)碾碎组织成粉末(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的xx毫升 裂解液(Reagent B)
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
  • 置于冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下) 
  • 准备1个小型漏斗,内衬尼龙丝或150微米的尼龙网(nylon mesh),置于15毫升锥形离心管上
  • 将所有组织匀浆物移入到小型漏斗里过滤
  • (选择步骤)或者放进4台式离心机离心10分钟,速度为1000g
  • 小心移取无渣液分装到预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1
  • 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作(注意:后续操作须在2小时内完成)

 

二、测定准备

 

  • 从-70℃取出待测样品(例如植物组织裂解悬液样品等),置于冰槽里
  • 设定好分光光度仪(温度为25℃):波长为540nm,并置零 
  •  缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
  • 测定开始前,移出xx微升 底物BReagent F到新的1.5毫升离心管,加入xx微升 底物AReagent E,混匀后,置于冰槽里,标记为 底物工作液(2次操作),放在暗室里备用。然后进行下列操作

 

  • 标准样品测定

 

  • 准备好5个2.2毫升离心管,标记为1至5号管
  • 分别加入xx毫升 缓冲液(Reagent C)到1至5号管
  • 移取xx毫升 标准液(Reagent H到1号管,混匀
  • 小心移取xx毫升1号管稀释的 标准液(Reagent H到2号管,混匀
  • 小心移取xx毫升2号管稀释的 标准液(Reagent H到3号管,混匀
  • 小心移取xx毫升3号管稀释的 标准液(Reagent H到4号管,混匀
  • 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表

 

管号

 缓冲液(Reagent C)

 标准液(Reagent H

标准麦芽糖浓度

1

xx毫升

xx毫升

xx毫摩尔/升

2

x x毫升

xx毫升1号管

xx毫摩尔/升

3

xx毫升

x x毫升2号管

xx毫摩尔/升

4

x x毫升

xx毫升3号管

xx毫摩尔/升

5

xx毫升

0

0

 

  • 分别移取xx微升上述配制的系列 标准液(Reagent H1.5毫升离心管
  • 分别加入500微上述配制的 底物工作液
  • 在沸水里孵育5分钟 ,避免光照
  • 在室温下静置15分钟冷却,避免光照
  • 分别移取100微升上述反应液到新的比色皿
  • 分别加入xx毫升 补充液(Reagent G,混匀
  • 即刻放进分光光度仪检测:获得吸光读数
  • 重复实验步骤8至14四次
  • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位;横座标(X轴)为标准麦芽糖浓度(摩尔/升

 

  • 样品和背景测定

 

  • 移取xx微升 缓冲液(Reagent C)到新的1.5毫升离心管
  • 加入50微升待测样品(100微克裂解萃取蛋白)或 补充液(Reagent G)
  • 25温度下,孵育3分钟
  • 分别加入xx微升 反应液(Reagent D),混匀
  • 25温度下,孵育3分钟
  • 分别加入xx微上述配制的 底物工作液
  • 在沸水里孵育5分钟,避免光照
  • 在室温下静置15分钟冷却,避免光照
  • 分别移取100微升上述反应液到新的比色皿
  • 分别加入xx毫升 补充液(Reagent G,混匀
  • 即刻放进分光光度仪检测:获得吸光读数
  • 实际样品吸光读数:样品吸光读数-背景吸光读数
  • 根据标准曲线获得样品对应麦芽糖浓度摩尔/升
  • 测算样品酶活性

 

 

注意事项

 

  • 本产品为25次操作,包括标准样品测定
  • 操作时,须戴手套
  •  底物工作液注意避光
  • 样品检测前,须溶解和澄清
  • 比色测定后,比色皿须清洗*
  • 测定值由低到高变化,表明有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升;如果样本酶活性过低,则可以增加样本量(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • a-淀粉酶活性单位浓度定义:在25℃室温下,pH 6.9的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)释放1微摩尔的麦芽糖分子
  • 本公司提供系列淀粉学分析技术产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测准确

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