上海铭博生物实验室技术告诉您---细胞系开发过程中IgG检测流程的简化

在不同的研究人员中，以抗体为基础的治疗药物的细胞系开发过程可能有很大不同。终目标是找到可以稳定产生大量单克隆抗体的细胞克隆。IgG 产物检测在开发和生产单克隆抗体的多个阶段都是非常重要的一步 ( 图 1 )。通常 IgG 定量的方法都需要专门的仪器和技术人员，例如 HPLC 和表面干涉测量，或是要花费大量时间的 ELISA 检测 ( 酶联免疫吸附实验 )。尽管 ELISA 是蛋白定量的成熟方法，但它也是一种冗长的、多个步骤的实验过程 ( 表 1 )。这里，我们向大家介绍使用 Valitacell 公司Valita®TITER实验来检测抗体开发和生产过程中 IgG 的方法。

ValitaTITER 实验使用简单“add-and-read”( 添加和读数 ) 方式测定 2.5 ‒ 100 mg/L 浓度的 IgG。此实验过程不到 1 小时即可完成且能够整合到以 96 孔板为规格的生物反应工作流程中。此实验可实现高通量和全自动。其过程可在细胞培养基中用少量样品进行，没有复杂的准备步骤。

可用于实验检测的 Molecular Devices 公司多功能微孔读板机有：SpectraMax®iD5多功能微孔读板机、带荧光偏振检测卡盒的 SpectraMax® i3x 多功能微孔读板机和 SpectraMax® M5 多功能微孔读板机。

图 1 从细胞转染到扩大生产的细胞系开发过程

优点

• 轻松采集数据并利用 SoftMax Pro软件的预设模板分析数据
• 快速、均相实验，不超过 1 小时即可获得结果
• 2.5-100 mg/L IgG 浓度范围的测定

表 1 比较 ValitaTITER 实验与其他方法在 IgG 定量检测方面的性能表现

实验原理

ValitaTITER 实验基于对 IgG Fc 片段与蛋白 G 的相互作用采用荧光偏振 ( FP )技术检测。96 孔微滴度板的每个孔中都包被有荧光标记的 IgG 结合多肽，蛋白 G。当加入样品到孔板中时，蛋白G 分子被重悬并发生结合。一旦结合抗体，蛋白 G 分子的运动速率便会下降，导致荧光偏振 ( FP ) 值的增加 ( 图 2)。

图 2 ValitaTITER 实验原理使用 FP 技术检测。自由的蛋白 G 分子很小且在缓冲液中快速旋转。结果是偏振激发光丢失了偏振性 ( 上图 )。当蛋白 G 分子在样品中结合了抗体，较大的复合体旋转就会减慢导致 FP 值的增加 ( 下图 )

材料

• ValitaTITER 检测试剂盒(Valitacell cat. #00010)
• IgG 蛋白标准品 (Sigma cat. #I2511)
• CD CHO 培养基(Thermo Fisher Scientific cat. #10743011)
• 实验过程中的样品：悬液培养产生CHO 细胞系的重组 IgG 培养上清液
• 安装有 535-nm FP 发射滤片的SpectraMax iD5 多功能微孔读板机
• 带有荧光偏振 ( FP-FLUO ) 检测卡盒的 SpectraMax i3x 多功能微孔读板机
• SpectraMax M5 多功能微孔读板机

方法

IgG 标准品梯度稀释到 CD CHO 细胞培养基中使浓度在 2.5 和 100 mg/L 之间。细胞培养上清中的一系列 IgG 样品按需要稀释到细胞培养基中。加入 60 µLValitaMab 重组缓冲液到 ValitaTITER板的每个孔中，然后再迅速加入 60 µL准备好的细胞样品或蛋白标准品。混匀样品或标准品并在室温下避光孵育30 分钟。在 SpectraMax iD5 读板机上 使 用 内 置 的 光 栅 光 路 激 发 并 用535-nm 发射滤片检测FP 信号。使用SoftMax Pro 软件中的预设模板获取数据并进行分析 ( 图 3 )。同样在Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 读板机上检测 FP 以验证它们的性能表现 ( 数据未示 )。

用蛋白 A 的 HPLC 数据对比。根据生产厂家操作说明进行实验。

图 3 ValitaTITER 实验流程。(A) ValitaMab 重组缓冲液加入到 ValitaTITER 板的每个孔中。(B) 样品或 IgG 标准品加入到孔中。(C) 孔板孵育 30 分钟为结合的发生。(D) 使用 SoftMax Pro 软件在SpectraMax iD5 读板机上检测 FP

结果

ValitaTITER 实验利用简单的“add-and-read”( 添加和读数 ) 方式获得 IgG 标准曲线，中间无洗涤步骤且只需少量样品 ( 5-30 µL )。在 SpectraMax iD5读板机上使用内置的光栅激发光路和535-nm FP 射滤片可获得*结果。浓度从 3.1 到 100 mg/L 的标准品所检测到的结果在整个浓度范围内均保持了高度线性 (r 2 = 0.998) ( 图 4 )。Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 读板机也获得了相似的数据 ( 数据未展示 )。SoftMax Pro 软件中的预设模板可自动计算出 mP 结果并绘制曲线图。对进料间歇反应器条件培养基样品的ValitaTITER 实验结果与 HPLC 进行了
比较。两种方法呈现出高度的一致性，r 2 = 0.994 ( 图 5 )。

图 4 使用 ValitaTITER 实验在 SpectraMax iD5 读板机上生成 IgG 标准曲线。数据采用SoftMax Pro 软件中的线性拟合绘制曲线图 (r 2 = 0.998)。误差线表示 6 个重复标品的标准偏差

图 5 ValitaTITER 实验的 IgG 定量结果和蛋白 A 的 HPLC 分析结果进行比较。进料间歇生物反应器中一系列条件培养基的 IgG 滴度通过 ValitaTITER 荧光偏振实验进行定量。这些样品同样也通过蛋白 A 的 HPLC 进行分析

总结

IgG 定量必须在细胞系开发过程的多个步骤中进行以保证终扩大化生产的产品质量，因此一种以尽可能少的时间获得准确结果的测定方法对成功至关重要。这里我们展示了由 ValitaTITER实验得到的IgG 定量数据与 HPLC 的分析结果高度匹配，后者被广泛认为是检测的金标准，然而前者所需的时间还不到 HPLC 的 3% 。ValitaTITER 实验是一种均相的、高通量的方法，可在细胞系开发工作流程中快速的检测 IgG 含量。这种实验的96 孔板检测已在 SpectraMax iD5 读板机和其他具有 FP 功能的 MolecularDevices 公司读板机上被充分验证通过，保证结果的可靠性。而 SoftMax Pro 软件则大大减少检测参数的设置时间并自动拟合标准曲线和计算样品浓度。