细胞血红素氧合酶-1（HEME OXYGENASE-1）活性比色法定量检测试剂盒
产品说明书（中文版）
主要用途
细胞血红素氧合酶-1（HEME OXYGENASE-1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过NADPH生成系统和血红素氧合酶反应系统中，血红素被水解为胆绿素后其吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品血红素氧合酶-1的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
血红素氧合酶（heme oxygenase；HO；EC1.14.99.3）是一种催化血红素分解代谢的微粒体内限速酶，即通过氧化降解游离血红素为一氧化碳、自由铁和胆绿素（biliverdin）或结合血红素产物胆绿素蛋白（verdoglobin）。血红素氧合酶存在于体内的所有细胞中，在脾脏中活性高，旨在处理衰老的红细胞。血红素氧合酶有3种同工酶：I型为诱导型，又归类为热休克蛋白32K（heat shock protein 32K），受到氧化应激、一氧化氮、缺氧、重金属、细胞因子等激发；II型为结构型，维持体内内平衡，在脑组织、睾丸、血管上皮细胞高度表达；III型为结构型，具有氧感受作用，不具有催化活性。其中诱导型血红素氧合酶（血红素氧合酶-1；HO-1）是机体重要的内源性保护物质之一，广泛参与组织细胞的抗氧化应激损伤，是在细胞受损维持其氧化和抗氧化动态平衡的关键因素，成为炎性反应的调节靶标。此外，淤青的形成便是血红素氧合酶的作用，由红色的血红素转变为绿色的胆绿素，后变成黄色的胆红素（bilirubin）。基于底物血红素（heme），由NADPH生成系统（NADPH generating system）的参与，在血红素氧合酶-1选择性敏感抑制剂咪唑-二氧戊环化合物（imidazole-dioxolane compound）QC-13[(2R,4R)-2-[2-(4-chlorophenyl)ethyl]- 2-[(1H-imidazol-1-yl) methyl]-4-methyl -1,3-dioxolane hydrochloride]存在与否的情况下，由血红素氧合酶催化分解作用下，产生一氧化碳、自由铁和胆绿素（biliverdin），由此出现吸光峰值的变化（464nm和530nm波长），来定量测定血红素氧合酶-1的特异活性。其反应系统为：
glucose-6-phosphate dehydrogenase
D-glucose-6-phosphate + NADP+ → NADPH + 6-Phospho-D-gluconate
heme oxygenase-1
Heme + 2 NADPH + O2 → biliverdin + Fe2+ + CO + 2 NADP+ + H2O
QC-13
产品内容
清理液（Reagent A） 120毫升
裂解液（Reagent B） 70毫升
缓冲液（Reagent C） 40毫升
反应液（Reagent D） 2毫升
底物液（Reagent E） 2毫升
阴性液（Reagent F） 1毫升
终止液（Reagent G） 40毫升
专性液（Reagent H） 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存 反应液（Reagent D）、 底物液（Reagent E）和 专性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照； 终止液（Reagent G）具有腐蚀性，注意安全；有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
2毫升离心管：用于样品反应的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
恒温水槽：用于孵育反应
微型台式离心机：用于样品操作
超速离心机：用于样品操作
涡旋震荡仪：用于混匀反应
比色皿：用于反应和比色的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
- 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
- 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
- 小心抽去清理液
- 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
- 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
- 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
- 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
- 小心抽去上清液
- 加入3毫升预冷的 裂解液（Reagent B）
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
- 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）
- 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
- 放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为9000g
- 移取上清液到2个新的1.5毫升离心管
- 放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
- 小心抽去上清液
- 分别加入200微升 裂解液（Reagent B）
- 合并到1个1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－ MB30030.1）
- 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
- 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里
- 设定好双波长分光光度仪（温度为37℃）：波长分别为464nm和530nm，并置零
- 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
- 准备2个2毫升离心管，标记为背景管和样品管
- 分别移取850微升 缓冲液（Reagent C）
- 分别加入50微升 反应液（Reagent D）
- 分别加入50微升 底物液（Reagent E）
- 加入50微升 阴性液（Reagent F）到背景管
- 加入50微升待测样品（100微克微粒体蛋白或500微克细胞裂解萃取液蛋白）到样品管（注意：样品须清澈）
- 盖上盖子，上下倾倒数次，混匀
- 在37℃温度下孵育60分钟
- 分别加入1毫升 终止液（Reagent G）
- 涡旋震荡15秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
- 分别移取1毫升绿色液相液体到比色皿
- 即刻放进分光光度仪检测
- 记录实际吸光读数：吸光读数464nm—吸光读数530nm
检测开始前，分别加入50微升 专性液（Reagent H）和待测样品（注意：（100微克微粒体蛋白或500微克细胞裂解萃取液蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
- 准备2个2毫升离心管，标记为背景管和样品管
- 分别移取800微升 缓冲液（Reagent C）
- 分别加入50微升 反应液（Reagent D）
- 分别加入50微升 底物液（Reagent E）
- 加入50微升 阴性液（Reagent F）和 专性液（Reagent H）到背景管
- 加入100微升上述预处理的待测样品到样品管
- 盖上盖子，上下倾倒数次，混匀
- 在37℃温度下孵育60分钟
- 分别加入1毫升 终止液（Reagent G）
- 涡旋震荡15秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
- 分别移取1毫升绿色液相液体到比色皿
- 即刻放进分光光度仪检测
- 记录实际吸光读数：吸光读数464nm—吸光读数530nm
五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 40000（微摩尔吸光系数）X 1（反应时间；小时）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝纳摩尔胆绿素/小时
2）样品特异活性计算
特异活性＝总活性－非特异活性
注意事项
- 本产品为20次（比色皿）操作，包括背景对照
- 操作时，须戴手套
- 终止液（Reagent G）具有腐蚀性，注意操作安全
- 系统操作过程中，背景测定只需1次
- 样品须澄清，至关重要
- 如果酶活性过低，可以增加反应时间至2小时
- 比色测定后，比色皿须清洗*
- 可以使用血红素氧合酶诱导剂硫酸铜（EC50=0.24毫摩尔）作为诱导剂对照或阳性对照
- 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为100微克/50微升；待测样本为细胞裂解悬液，其总蛋白浓度为250至500微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 MB30030.1）
- 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
- 血红素氧合酶-1单位活性定义为：在37℃，pH 7.4条件下，每小时内能够产生1纳摩尔胆绿素所需的酶量作为一个活性单位
- 本公司提供系列血红素氧合酶检测试剂产品
质量标准
