细胞醛缩酶（ALDOLASE）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒

MB50110.1 v.A

 细胞醛缩酶（ALDOLASE）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞醛缩酶（ALDOLASE）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂是一种旨在通过醛缩酶、磷酸丙糖异构酶和α-甘油磷酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）醛缩酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

醛缩酶（aldolase；ALD；EC 4.1.2.13），又称为果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphate aldolase），是糖酵解通路中的成员之一，存在于所有动物、植物和大部分微生物中。主要分为两大类：I类在动物和高等植物中存在，其特征是无需二价金属辅因子参与；II类在原发细胞（primitive cell）包括酵母和细菌中存在，金属辅因子必需。动物组织的醛缩酶为同源四聚体，分子量约为160KD，主要有三种异构体：A、B、C型，其催化的反应产物均是看家基因相关性产物。发育胚胎、成年肌肉和红细胞中产生A型醛缩酶；成年肝脏、肾脏和小肠产生B型醛缩酶；而脑组织、其它神经组织以及平滑肌产生C型醛缩酶。醛缩酶催化果糖-1,6-二磷酸（fructose 1,6-bisphosphate；F-1,6-BP）的可逆性转化反应，又称为醇醛缩合反应（aldol reaction），产生3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate；GA3P）和磷酸二羟丙酮（dihydroxyacetone phosphate；DHAP）。A型缺失将导致肌病和溶血性贫血；B型异常将引起遗传性乳糖不耐受症（hereditary fructose intolerance）。基于果糖-1,6-二磷酸在醛缩酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛后，通过磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase）和α-甘油磷酸脱氢酶（α－glycerol phosphate dehydrogenase）系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm 波长），来定量分析果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的总活性。其酶连续循环反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 缓冲液（Reagent C） 毫升

 底色液A（Reagent D1） 毫升

 底色液B（Reagent D2） 毫升

 反应液（Reagent E）   毫升

 阴性液（Reagent F）   毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）、 缓冲液（Reagent C）、 底色液A/B（Reagent D1/D2）和 反应液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 底色液（Reagent D）和 反应液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 底色液B（Reagent D2）避免光照
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 底色液A（Reagent D1）
• 加入xx微升 底色液B（Reagent D2）
• 加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入xx微升 阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－5分钟读数）

• 样品测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 底色液A（Reagent D1）
• 加入xx微升 底色液B（Reagent D2）
• 加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－5分钟读数） 

五、计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分别加入xx微升 底色液A（Reagent D1）
• 分别加入xx微升 底色液B（Reagent D2）
• 分别加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升 阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算

注意事项

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要 
• 加样后3秒内光度测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续5分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 醛缩酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够切离1微摩尔果糖－6－磷酸所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感