线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

MB50007 v.A

  线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的*步。基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：

产品内容

  缓冲液（Reagent A）  毫升

  反应液（Reagent B）  毫升

  阴性液（Reagent C）    毫升

  底物液（Reagent D） 微升

  专性液（Reagent E）   微升

产品说明书    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；  反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于比色分析的容器

双波长分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；  缓冲液（Reagent A）室温预热；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里 
• 设定好双波长分光光度仪（温度为30℃）：波长分别为340nm和380nm，间隔30秒，读数7次（共3分钟），并置零 

• 背景对照测定

• 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反应液（Reagent B） 
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升  阴性液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟 

• 样品总活性测定

• 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反应液（Reagent B）
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟

• 样品非特异活性测定

• 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反应液（Reagent B）
• 加入xx微升  专性液（Reagent E）
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟 

• 计算样品活性

1）样品活性（总活性或非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项

• 本产品为21次（10个样本）操作，包括背景对照测定
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3次
• 如果增强酶活检测，建议使用  线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－GMS10342
• 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
• 如果样本存在明显干扰，可以选择进行样本背景对照测定，即不加  反应液（Reagent B），加入待测样品替代  阴性液（Reagent C）
• 通常反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续3分钟
• 测定值由高到低变化，即3分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右
• 如果用户没有双波长同步测定分光光度仪，可以使用单波长340nm替代，注意活性计算时，毫摩尔吸光系数变成6.2
• 建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供  线粒体溶解试剂盒GMS10018为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为50微克/100微升
• 样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q还原酶，去除其它干扰因素（例如复合物II/III/IV等）
• 如果用户需要研究线粒体呼吸链复合物I总活性包括鱼藤酮敏感和抗性之和，请咨询技术顾问，另购  补充反应液（Reagent B+）
• 线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确