植物总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒

植物总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 植物总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针，受到有机氮自由基AAPH的破坏，但在抗氧化剂的存在下，得到抑制，由此通过荧光分光光度仪，观察其峰值下降程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于适用于各种新鲜织物组织包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）等裂解悬液中总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用荧光素（fluorescein）作为探针，2,2'-偶氮二异丁基脒（（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作为过氧自由基供体（peroxyl radical donor），其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在荧光分光光度仪（激发波长485nm±20，散发波长528nm±20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

产品内容

 清理液（Reagent A）     毫升

 低渗液（Reagent B）     毫升

 缓冲液（Reagent C）     毫升

 染色液（Reagent D）     毫升

 氧化液（Reagent E）     管

 标准液（Reagent F）     微升

产品说明书     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）、 低渗液（Reagent B）和 缓冲液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于组织匀化

超声仪：用于破碎细胞

200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的xx毫升 低渗液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）
• 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管
• 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
• 超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 使用 清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/25微升
• 置于冰槽里备用

二、标准液准备

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到2至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent F）到1号管，混匀
• 小心移取xx微升1号管的 标准液（Reagent F）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent F）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent F）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 样品测读

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取xx毫升 缓冲液（Reagent C）到1管 氧化液（Reagent E）里，混匀，置于暗室里，标记为 氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个黑色96孔板，做好标记：大对照孔、标准样品孔、待测样品孔
• 分别移取xx微升 染色液（Reagent D）到黑色96孔板里的每个孔里
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到大对照孔
• 加入xx微升上述配制的 标准液（Reagent F）到相应标准样品孔里
• 加入25微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里
• 放进37℃培养箱里孵育30分钟
• 分别加入xx微升 氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里 
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到大对照孔
• 轻轻摇动黑色96孔板，使其混匀
• 放进37℃培养箱里孵育15分钟
• 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪里测读：激发波长485nm±20，散发波长528nm±20
• 分析结果：
  • 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为荧光单位；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 大对照孔为大荧光单位读数
  • 标准样品孔和待测样品孔为实际荧光单位读数
  • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 计算样品实际总抗氧化能力

• 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）

【实际荧光单位读数÷大对照孔荧光单位读数】X 100％

• IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白量（毫克/毫升）或样品细胞量（10⁶细胞）

注意事项

• 本产品为50次操作，包括标准品
• 本产品测试范围为100纳摩尔至1微摩尔Trolox等值
• 操作时，须戴手套
• 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
• 用户可以调整标准曲线区间
• 测试前，样品须新鲜收集
• 样品须清澈
• 样品读数越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
• 可以使用比色皿检测
• 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低， 建议稀释或增加样品容量或浓度
• 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
• 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感