血液活化凝血因子X（FACTOR Xa）活性比色法定量检测试剂盒

血液活化凝血因子X（FACTOR Xa）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

  血液活化凝血因子X（FACTOR Xa）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA，在凝血因子X激活酶存在与否的情况下，受到活化凝血因子X的水解，释放黄色对硝基苯胺，产生吸光峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种血浆样品（动物、人体等）活化凝血因子X（FACTOR Xa）的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

凝血因子X（FACTOR X；FX；EC3.4.21.6），又称为斯图亚特因子（Stuart-Prower Factor）或凝血酶原酶（prothrombinase），是一种丝氨酸内肽酶（serine endopeptidase）， 存在于血液循环中的凝血蛋白，由45Kd重链和17Kd轻链组成，是凝血瀑布反应中的主要酶之一，即凝血酶（thrombin）通路的个成员。凝血因子X在维生素K的参与下，在肝脏合成，半衰期为40至45小时。凝血因子X通过凝血因子IX-凝血因子VIII复合体（内在性因子X酶；intrinsic Xase）和凝血因子VII-组织因子复合体（外在性因子X酶；extrinsic Xase）激活为活化因子X（FACTOR Xa；FXa）。同时可以被鲁塞尔蝰蛇毒X（Russell viper venom；RVV-X）和胰蛋白酶（trypsin）激活。受到蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂（protein Z-dependent protease inhibitor；ZPI）抑制。其功能在于切离凝血因子II，产生活化因子II，即凝血酶（thrombin）。凝血因子X缺陷将导致鼻出血（epistaxis）、关节血肿（hemarthrosis）、胃肠道失血、淀粉样变性（amyloidosis）等。此外活化凝血因子X抑制剂用于抗凝血治疗，包括肝素（heperin）。凝血酶的目标蛋白切离部位为Arg-Thr和Arg-Ile。基于人工合成的多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA（苯酰-异亮氨酰-谷氨酰-γ- OR-甘氨酰-精氨酰对硝基苯胺），在凝血因子X激活酶鲁塞尔蝰蛇毒X（Russel Viper Venom X；RVV-X）存在与否的情况下，受到活化因子X的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定活化凝血因子X的活性。其反应系统为：

产品内容

  缓冲液（Reagent A） 毫升

  阴性液（Reagent B）   毫升

  底物液（Reagent C）   微升

  活化液（Reagent D） 微升

产品说明书    1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent C）避免光照和反复冻融；  活化液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器

微型台式离心机：用于样品沉淀

培养箱：用于反应物孵育

酶标板或比色皿：用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

• 样品制备

• 准备好ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA和肝素抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

• 测定准备

• 准备好上述制备的待测样品
• 设定好酶标仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零
• 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。  缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 活化因子X（FXa）测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到相应孔中
• 分别加入xx微升  阴性液（Reagent B）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 分别加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 轻轻摇动96孔酶标板（注意：避免气泡）
• 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
• 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
• 活性计算：

• 酶标仪检测

• 比色皿检测

• 凝血因子X（FX）测定

检测开始前，移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升  活化液（Reagent D）和待测样品（注意：50微克蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育5分钟。然后继续下列操作。

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到所有孔里
• 加入xx微升  阴性液（Reagent B）到背景对照孔里
• 加入20微升上述制备的待测样品到样品孔里
• 分别加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 轻轻摇动96孔酶标板（注意：避免气泡）
• 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
• 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
• 活性计算：

• 酶标仪检测

• 比色皿检测

注意事项

• 本产品为21次操作，包括背景对照
•   活化液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，且避免反复冻融
• 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 样品中含有500微摩尔以下总胆红素（bilirubin）、300微摩尔以下血红蛋白（hemoglobin）不会干扰检测
• 活化因子X单位活性定义为：在37℃，pH 8..6条件下，每分钟内能够切离1微摩尔多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞蛋白酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感