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细胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性

更新时间:2021-03-10 点击次数:2148

 细胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

  细胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后,在碱性环境下,呈现黄色,即采用比色法来测定样品中酶活性*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品中β氨基己糖苷酶的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidaseEC3.2.1.52.又称为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl--β-D-GlucosaminidaseNAGase)属于含有20个糖苷水解酶(glycoside hydrolase)家族,也是肽聚糖水解酶,为溶酶体细胞器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖残基(N-acetyl-D-hexosamine   residues),参与细胞内糖蛋白和糖脂的分解代谢,包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶为同源二聚体结构,有αβ两个亚体构成:HEXAHEXB。人体缺乏HEXAHEXB,将导致神经退行性相关的疾病,例如家族黑蒙性病(Tay-Sachs病)和神经节苷脂贮积病  Sandhoff )。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminidePNP-NAG),在β氨基己糖苷酶的作用下,水解释放出硝基苯酚(p-nitrophenol)和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-acetyl-β-D-glucosamineNAG,在碱性环境下,呈现出黄色,在分光光度仪下,产生吸光峰值变化405nm 波长),来定量分析β氨基己糖苷酶的活性。反应系统为:

       

产品内容

 

  缓冲液(Reagent A  毫升

  反应液(Reagent B  毫升

  碱性液(Reagent C    毫升

  阴性液(Reagent D    微升

  清理液(Reagent E  毫升

  裂解液(Reagent F  毫升

产品说明书     1

 

保存方式

 

保存  反应液(Reagent B在-20冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里,有效保证6

 

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

细胞脱棒:用于细胞脱离

(微型)台式离心机:用于样品操作

比色皿或96孔板:用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

  • 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞15 X 107细胞
  • 小心加入xx毫升  清理液(Reagent E,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入xx毫升  清理液(Reagent E,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升  裂解液(Reagent F,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-   30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取悬液样品等),置于冰槽里
  • 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长405nm,并置零
  •   缓冲液(Reagent A室温下均衡温度

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取xx微升  缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入xx微升  反应液(Reagent B
  • 加入xx微升  阴性液(Reagent D
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育10分钟
  • 加入xx微升  碱性液(Reagent C
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育5分钟
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照

 

  • 样品测定

 

  • 移取xx微升  缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入xx微升  反应液(Reagent B
  • 加入50微升待测样品(50微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH小于7.5
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育10分钟
  • 加入xx微升  碱性液(Reagent C
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育5分钟
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数 

 

四、计算样品活性

 

 

  • 酶标仪测定

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升  缓冲液(Reagent A到相应孔
  • 分别加入xx微升  反应液(Reagent B
  • 分别加入xx微升  阴性液(Reagent D待测样品(20微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH小于7.5
  • 轻轻摇动96孔板
  • 37温度下孵育10分钟
  • 分别加入xx微升  碱性液(Reagent C
  • 轻轻摇动96孔板
  • 37温度下孵育5分钟
  • 即刻放进酶标仪检测 
  • 活性计算

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品须澄清,至关重要
  • 建议使用比色皿测定
  • 加样后3秒内比色测定
  • 测定值由变化;测定可持续10分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗*
  • 样本测定10分钟读数0分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量(本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒   30030.1
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • β氨基己糖苷酶单位活性定义为:在37pH 4.25条件下,每分钟内能够释放1微摩尔硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

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