ELISA（免疫酶联吸附实验）是免疫学基础实验之一，大部分生命科学领域的科研工作者对其都不陌生。因为其特异性强，灵敏度高，可精确定量的特性，在基础科研和临床诊断中，ELISA技术都应用广泛，相信很多关注我们的小伙伴也都做过ELISA。 ELISA实验步骤少，流程短，购买的即用型试剂盒也都有指导性很强的操作说明书，单次实验3-6小时即可得到结果，实验小白也可以很快的上手。但是，各位同学可不要轻视哦，ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样，都是易学难精，上手容易，但想要得到稳定的结果，还是要花一点心思的。这里汇总了一些做ELISA的客户咨询我们的问题，把其中有代表性的集中做成了FAQ，大家快看看这其中有没有困扰你ELISA实验的问题吧！
1：ELISA可以检测胞内蛋白么？ 可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。如需检测胞内蛋白，首先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。
2：ELISA可以测DNA的表观么？不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP技术。
3：夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。
4：试剂盒里面有捕获抗体么？即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。非即用型的ELISA试剂盒会有捕获抗体提供，需按照说明书推荐的工作浓度，用稀释液稀释后自行包被。
5：捕获抗体如何包被在96孔板上？如果选用的是生物即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被，因为试剂盒中的检测抗体已经事先包被在检测板中；如果是非即用型的ELISA试剂盒，需要自己在实验前提前进行抗体包被，简要步骤入下：首先，要选择ELIS*别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液将捕获抗体稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，再每孔加100 μl（96孔板加样量）稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后再次洗板即可使用，如需长期保存，则需要真空冻干后保存。
6：ELISA实验中，酶标抗体是什么抗体？识别的目标又是什么？这个问题需要具体分析，在直接法ELISA中，酶标抗体直接识别抗原，即可检测，但缺少二抗放大，且灵敏性不高。在间接法ELISA中，酶标抗体作为二抗，识别检测抗体。而在目前应用*的双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的也是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。
7：试剂盒有推荐样本稀释浓度还需要自己测吗？生物试剂盒一般会给出不同样品类型的的推荐稀释比例，但是为大致范围，最好还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。尤其是待测蛋白为炎症因子时，因为在不同组别样本间差异巨大，更是需要预实验检测后稀释。
8：做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。
9：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。
10：配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？ 针对艾迪抗的ELISA试剂盒来讲，在说明书中有各组分拆开后的保质期，配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存，保质期为一个月左右。剩下的板子和试剂在保质期内是可以继续用于正式实验的，为保证实验质量，还是建议间隔时间不要太长，一周之内更好，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。
11：in vivo实验周期长，不太好做预实验，对ELISA结果会有影响么？怎么办？如果您实验室之前建立的in vivo实验protocol经过验证，可以保证有效性，那么，可以不用再进行相关的预实验；并且，如果实验周期较长，样本获取不易，同时又需要检测较多指标，建议将样品分装冻存，避免反复冻融。ELISA实验还是建议进行一下预实验，摸清楚样本的最佳稀释比例，取得更好的实验结果。
12：检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。因不同处理，可能会导致细胞生产状态不同，要保证在铺板时接种细胞数量水平一致。
13：打开试剂盒，发现wash buffer析出结晶，对实验结果有影响么？怎么办？ wash buffer为高浓度盐溶液，在低温保存条件下，有可能出现结晶析出，为正常现象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的结晶会溶解，溶解后可正常使用。不可以在结晶存在的情况下配置wash buffer。
14：一般ELISA试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？ HRP酶标二抗的ELISA试剂盒，显色底物一般为TMB，TMB不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，一般试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。
15：同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？应考虑的问题包括：样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存；样品冻融之后未混匀，应混匀后再上样；加样不准确，微量样品加样时要注意移液器枪头不要有残留
16：副孔差别比较大，是没洗干净吗？复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。加样应注意移液器量程，以及枪头残留问题；洗板过程应注意不要有残留液体，需要进行拍干操作；孵育过程要更换封板膜，拍干过程要换吸水纸，避免交叉污染。
17：加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大，是什么原因？加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。
18：整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
19：封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。
20：ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？生物实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。
21：手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。
22：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。
23：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。
24：测得的值都低于标准曲线的低值，是什么原因，应该怎么解决？ 这种情况需要设置实验对照组来排查，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，检查其他待测样品是否稀释倍数过高，可以降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，则表明该指标在其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。
25：标准曲线在推荐的浓度下，r2值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？这种情况首先要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，一般的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r2值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验过程中是否出现污染或标准品倍比稀释时出现失误，导致加样不准。
26：样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达*的蛋白，确实会出现这种情况，之前接到过的案例，样品需要稀释10000倍，目的蛋白才落在检测区间内。建议继续提高稀释比例。
27：最后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？ 有的，建议标准曲线最高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。
