植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定植物裂解样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等查尔酮合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
查尔酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮体合成酶（polyketide synthase；PKS）大家属中的一员，是启动类黄酮（flavonoid）化合物合成通路中第一步关键酶，形成植物系统性获得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基础。查尔酮合成酶存在于细菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各种不同发育阶段中的不同组织中表达。查尔酮合成酶为同源二聚体，分子量为40至4000Kd，由环境压力，包括UV照射、伤口、病原菌袭击等诱导，通过丙二酰辅酶A脱羧基反应（decarboxylation）、与香豆酰辅酶缩合、聚酮体链延展（chain elongation）、中间产物环状化（cyclization）和芳构化（aromatization）产生查尔酮，一种类黄酮化合物前体，作为化学信使，由此生成各种后续继发性代谢化合物，参与抗病原微生物例如异黄酮植物保护素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御环境压力（UV光保护）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系结瘤（symbiotic root nodulation），以及作为抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤和抗真菌的药物作用。还在细菌的囊肿形成和阿米巴细胞分化中产生作用。基于香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A，在敏感性抑制剂木犀草素（Luteolin）存在与否的情况下，受到查尔酮合成酶的作用，缩合产生查尔酮，并释放出巯基辅酶A（CoA-SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析查尔酮合成酶的活性。查尔酮合成酶反应系统为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
底物液（Reagent E） 毫升
专性液（Reagent F） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存 缓冲液（Reagent C）、 反应液（Reagent D）和 底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 反应液（Reagent D）和 底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞
微型台式离心机：用于样品操作
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、 样品准备
1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6． 加入预冷的xx毫升 裂解液（Reagent B）
7． 涡旋震荡5秒，充分混匀
8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
9． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
11． （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12． 即刻移入到1.5毫升离心管
13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 反应液（Reagent D）和 底物液（Reagent E）避免光照； 缓冲液（Reagent C）室温下预热
三、 背景对照测定
1． 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升 底物液（Reagent E）
3． 在30℃温度下孵育3分钟
4． 加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）
5． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
6． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）
四、 样品总活性测定
1． 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升 反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升 底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）
五、 样品非特异活性测定
检测开始前，分别移取xx微升 专性液（Reagent F）和待测样品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后继续下列操作。
1． 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升 反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升 底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入40微升上述预处理的待测样品
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）
六、计算样品活性
1） 样品总活性和非特异活性计算
2）样品特异活性计算
七、 酶标仪测定
1）样品总活性测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和待测样品
2． 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔里
3． 加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到背景对照孔里
4． 加入xx微升 反应液（Reagent D）到待测样品孔里
5． 分别加入xx微升 底物液（Reagent E）到96孔板的所有孔里
6． 在30℃温度下孵育3分钟
7． 分别加入20微升待测样品（200微克蛋白）到96孔板的所有孔里（注意：样品须清澈）
8． 轻轻摇动96孔板
9． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数数
10． 活性计算：
2）样品非特异活性测定
检测开始前，分别移取xx微升 专性液（Reagent F）和待测样品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后继续下列操作。
1． 在96孔板上做好相应标记：待测样品
2． 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板的孔里
3． 加入xx微升 反应液（Reagent D）
4． 加入xx微升 底物液（Reagent E）
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入40微升上述预处理的待测样品
7． 轻轻摇动96孔板
8． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数数
9． 活性计算：
3） 样品特异活性计算
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 建议使用比色皿测定
4． 样品须澄清，至关重要
5． 加样后3秒内比色测定
6． 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
7． 比色测定后，比色皿须清洗*
8． 样本测定30分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
9． 如果待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11． 查尔酮合成酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.8条件下，每分钟内能够释放1微摩尔辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
12． 本公司提供系列聚酮体代谢检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
