真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种实验用真菌/酵母菌株细胞内氧化应激活性氧的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老和代谢等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。

技术背景

真菌/酵母细胞是一种低等单细胞真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单明了等原核生物的特点。作为模式生物，它具有比较完备的基因表达调控机制和表达产物的加工修饰能力，在分子遗传学方面认识早，*作为外源基因表达的细胞宿主。超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种*自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定细胞内活性氧族的浓度。

产品内容

  清理液（Reagent A）     80毫升

  染色液（Reagent B）    100微升

  稀释液（Reagent C）     20毫升

  溶解液（Reagent D）     10毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于真菌/酵母染色的容器

载玻片：用于染色观察

微型台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞

培养箱或恒温水槽：用于染色孵育

比色皿：用于荧光定量分析

（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

荧光分光光度仪：用于细胞荧光定量分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出5微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入995微升  稀释液（Reagent C），混匀后，标记为  染色工作液，置入冰槽里。然后进行下列操作。

• 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷细胞/毫升）
• 移入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升预冷的  清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重复实验步骤5至7一次
• 加入1毫升含有  染色液（Reagent B）和  稀释液（Reagent C）的  染色工作液，混匀（注意：参见注意事项7）
• 放进28℃培养箱里或恒温水槽孵育20分钟，避免光照
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升预冷的  清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升预冷的  清理液（Reagent A），混匀
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取5微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长490nm，散发波长530nm――

绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

1）移取500微升上述细胞悬液到1毫升比色杯

2）加入500微升  溶解液（Reagent D）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 操作时，避免污染母液
• 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 孵育时，必须避免光照
• 本产品染色剂不易洗掉，染色持久
• 根据不同菌株类型，可以调整  染色工作液的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色
• 本公司提供阳性对照甲萘醌溶液（GMS12041），观察细胞荧光增强现象
• 本公司同时提供  真菌/酵母细胞内活性氧初级荧光测定试剂盒（GMS10016.8），满足不同用户需求
• 本公司提供系列活性氧分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰