组织脂质过氧化氢（HYDROGEN PEROXIDE）含量比色法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

   组织脂质过氧化氢（HYDROGEN PEROXIDE）含量比色法定量检测试剂盒是一种旨在通过过氧化氢与二价铁离子的氧化反应，进而与显色染料二甲酚橙结合，产生紫色复合产物所呈现的吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解样品中脂质过氧化氢含量的*而经典的技术方法。该技术经过精心改良芬顿（Fenton）反应、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体等）脂质过氧化氢的浓度检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）是一种普遍存在的反应性毒性代谢副产物，通过线粒体呼吸链系统或氧化酶系统产生，受到过氧化酶（peroxidase）和过氧化氢酶（catalase）还原为水而去除。由于过氧化氢成为许多氧化应激状态相关的关键调节因子，诸如NF-ΚB信号通路、氢过氧化介导通路等，因此过氧化氢的产生与哮喘、动脉硬化、糖尿病血管病、骨质疏松症、神经性退行性病变和唐氏综合症等疾病关联。活化炎症细胞浆产生大量过氧化氢，而过氧化氢与铁离子反应，导致脂质过氧化。过氧化氢的含量检测，可以反映机体内的过氧化情况，同时反映机体内细胞活性、蛋白质糖基化、脂质氧化等，以及自由基损伤。脂质过氧化物，例如MDA，与过氧化氢水平之比，称之为过氧化指数（peroxidation index），作为评价过氧化氢诱导脂质过氧化的标记。基于底物过氧化氢，在酸性条件下，与二价铁（ferric）离子反应（Fenton 反应），氧化产生三价铁离子（ferrous）和羟自由基，进而三价铁离子与染料二甲酚橙（3,3'-Bis(N,N-di-(carboxymethyl)amino- methyl)-o-cresolsulfone-phthalein；xylenol orange）结合，形成稳定的紫色复合物，通过其吸收峰值的变化（560nm波长），来定量分析脂质过氧化氢的含量。其反应系统为：

产品内容

   清理液（Reagent A）  毫升

   裂解液（Reagent B）       毫升

   去干扰液（Reagent C）       微升

   反应液（Reagent D）  微升

   显色液（Reagent E）       毫升

   阴性液（Reagent F）     毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存   去干扰液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在在4℃冰箱里；   反应液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；   显色液（Reagent E）避免光照；试剂具有挥发性，注意密闭盖子。有效保证6月

用户自备

2毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

4℃（微型）台式离心机：用于样品处理

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升   清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个2毫升离心管
• 加入预冷的xx微升   裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）
• 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存（注意：保存限于1至2月）或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长560nm，并置零 
• 从4℃冰箱里取出试剂，室温下均衡；   显色液（Reagent E）避免光照

• 背景对照测定

• 移取90微升上述制备的待测样品到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升   去干扰液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒
• 在25℃温度下孵育30分钟
• 加入xx微升   阴性液（Reagent F）
• 加入xx微升   显色液（Reagent E）
• 涡旋振荡5秒
• 在25℃温度下孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为12000g
• 移取上清液到新的比色皿
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照 

• 样品测定

• 移取90微升上述制备的待测样品到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升   去干扰液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒
• 在25℃温度下孵育30分钟
• 加入xx微升   反应液（Reagent D）
• 移取xx微升   显色液（Reagent E）
• 涡旋振荡5秒
• 在25℃温度下孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为12000g
• 移取上清液到新的比色皿
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样本读数

五、计算样品浓度

注意事项

• 本产品为20次操作
• 本产品检测范围是1.微摩尔/升至1毫摩尔/升
• 操作时，须戴手套
•    反应液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全
• 避免使用EDTA、山梨醇、亚铁盐（ferrous salt）、果糖、蔗糖、葡萄糖、甲酸、SDS、Tween 20、Tween 80、NP-40、Triton X100等处理样品，否则干扰检测
• 样品须澄清，至关重要
• 如果用户没有匹配的滤波器，可以使用540至620nm波长的任一波长替代
• 测定值由低到高变化
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 待测样品过氧化氢浓度大于1毫摩尔，必须进行稀释，否则检测读数下降 
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 本公司提供系列过氧化氢检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感