JC-1线粒体膜电位检测试剂盒

JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒
产品信息
产品名称 产品编号 规格 保存
JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-1线
粒体膜电位检测试剂盒
40S60 100 tests（6 孔板） -20℃避光保存
产品描述
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一种以JC-1 为荧光探针，快速灵
敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，也是用来检测细胞早期凋亡的常
用方法。
JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针，JC-1 染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内。正常
线粒体内，JC-1 聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体
由于膜电位的下降或丧失，JC-1 只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不仅可用
于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以
通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时，只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
线粒体膜电势的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性
发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸内切酶G（EndoG）、凋
亡诱导因子（AIF）等从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C 的释放伴随膜电位的*丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联
效应。
本试剂盒提供了CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100 个样
品；对于12 孔中的样品，本试剂盒共可以检测200 个样品。
试剂盒组分
编号 组分 规格 保存方法
40706-A JC-1(200×) 5× 100 μl/管 -20℃避光
40706-B JC-1 染色缓冲液（5×） 80 ml -20℃避光，也可4℃保存
40706-C CCCP（50 mM） 20 μl -20℃避光
40706-D 超纯水 90 ml 4℃保存
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。
-20℃避光保存，尽量避免反复冻融，有效期一年。超纯水和JC-1 染色缓冲液（5×）也可4℃保存。
使用说明
1. JC-1 染色工作液的配制
六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为1ml，其他培养器皿的JC-1 染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50～100
万细胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取适量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧
烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1 染色工作液。
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2. 阳性对照的设置
把试剂盒中提供的CCCP（50mM）推荐按照1∶1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至50μM，处理细胞20 分钟。随后
按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常50μM CCCP 处理20 分钟后线粒体的膜电位会
*丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作
用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定或优化体系摸索*条件。
3. 对于悬浮细胞
1） 取10～60 万细胞，重悬于0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 分钟。
3） 在孵育期间，按照每1mL JC-1 染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 染色缓冲液（1×），并放
置于冰浴。
4） 37℃孵育结束后，600×g 4℃离心3～4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
5） 用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤2 次：加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600×g 4℃离心3～4 分钟，沉淀细
胞，弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600×g 4℃离心3～4 分钟，沉淀细胞，弃上清。
6） 再用适量JC-1 染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流
式细胞仪分析。
4. 对于贴壁细胞
对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
1） 对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1mL 细
胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
2） 加入1mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 分钟。
3） 在孵育期间，按照每1mL JC-1 染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 染色缓冲液（1×），并放
置于冰浴。
4） 37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤2 次。
5） 加入2mL 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
6） 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5. 对于纯化的线粒体
1） 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1 染色缓冲液（1×）稀释5 倍。
2） 0.9mL 5 倍稀释的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100μg 纯化的线粒体。
3） 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485nm，
发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm 时，可以在475～520nm 范围内设置激发波长。另
外，也可以参考下面步骤6 中的波长设置进行荧光检测。
4） 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。
6. 荧光观测和结果分析
检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；
检测JC-1 聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在zui大激发波长和zui大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1 聚
合物时可使用常来检测碘化丙啶或者Cy3 用的标准带通滤波器。检测JC-1 单体可使用常来检测绿色荧光化合物如FITC 的
标准带通滤波器。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜
电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

也可以使用双带带通滤波器如FITC/罗丹明， FITC/Texas Red 来同时检测两种荧光探针。
另外，由于红色的JC-1 信号淬灭比绿色快，所以用标准带通滤波器检测时先检测红色荧光并拍照。
注意事项
1） JC-1（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至
全部融解后使用。
2） 必须先把JC-1（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入JC-1 染色缓冲液（5×）。不可先配制JC-1
染色缓冲液（1×）再加入JC-1（200×），这样JC-1 会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。
3） 装载完JC-1 后用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤时，使JC-1 染色缓冲液（1×）保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。
4） JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在30 分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
5） 请勿把JC-1 染色缓冲液（5×）全部配制成JC-1 染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-1 染色缓冲液（5×）。
6） 如果发现JC-1 染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。
7） CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。
8） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。