细胞培养真菌污染定性荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

 细胞培养真菌污染定性荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞培养真菌污染定性荧光检测试剂盒是一种旨在通过特异性真菌细胞壁结合荧光染料使活体真菌立刻染色，呈现丝状体状蓝色荧光的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物细胞培养中真菌（霉菌）污染的定性检测。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，检测敏感，荧光清晰。

技术背景

细胞培养中的主要微生物污染包括支原体（mycoplasma）、细菌、真菌、酵母和病毒等。在含有抗生素的培养液中，低水平的真菌菌污染则难以观察和发现。Fluorescence brightener 28，又称为Calcofluor White M2R， 为一种特异性结合真菌细胞壁上纤维素（cellulose）和甲壳素（chitin），且紫外激发的蓝色荧光染料，其分子式为C₄₀H₄₄N₁₂O₁₀S₂，分子量916.98。一旦结合真菌细胞壁，呈现强力的蓝色荧光。细胞培养真菌污染定性荧光染色技术，通过Fluorescence brightener 28对真菌菌胞壁的染色，具有快速检测细胞培养中真菌的存在，在荧光显微镜下（激发波长365nm，散发波长425nm）下观察到蓝色丝状体。

产品内容

 清理液（Reagent A）   毫升

 染色液（Reagent B） 微升

 碱性液（Reagent C） 微升

产品说明书 1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里，避免光照； 碱性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

载玻片和盖玻片：用于样品染色的载体

台式离心机：用于悬浮细胞操作

细胞培养板或培养皿：用于培养细胞的容器

实验步骤

• 贴壁细胞培养检测

• 准备好待测细胞培养至50％铺满率 
• 小心移取5毫升细胞培养容器里的培养液到15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混匀
• 移取20微升混匀液到洁净的载玻片上
• 放进37℃培养箱孵育10分钟，使其晾干
• 快速在酒精灯火上加热固定（注意：切忌过热处理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在载玻片上，覆盖样品
• 室温下孵育5分钟
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在载玻片上
• （选择步骤）加上xx微升 碱性液（Reagent C）（注意：如果需要观察真菌结构成分）
• 盖上盖玻片
• 在室温下，暗室里孵育5分钟 
• （选择步骤）移去盖玻片，小心抽去染色液
• （选择步骤）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在载玻片上，覆盖样品
• （选择步骤）小心抽去清理液
• 封片处理
• 置于荧光显微镜下观察染（100至400倍放大倍数）：激发波长365nm，散发波长425nm（类同DAPI滤波器）

真菌呈现丝状体蓝色荧光

二、悬浮细胞培养检测

• 将待测悬浮细胞（1 X 10⁵总量）移入到15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心15分钟，速度为1000g 
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 移取20微升混匀液到洁净的载玻片上
• 放进37℃培养箱孵育10分钟，使其晾干
• 快速在酒精灯火上加热固定（注意：切忌过热处理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在载玻片上，覆盖样品
• 室温下孵育5分钟
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在载玻片上
• （选择步骤）加上xx微升 碱性液（Reagent C）（注意：如果需要观察真菌结构成分）
• 盖上盖玻片
• 在室温下，暗室里孵育5分钟 
• （选择步骤）移去盖玻片，小心抽去染色液
• （选择步骤）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在载玻片上，覆盖样品
• （选择步骤）小心抽去清理液
• 封片处理
• 置于荧光显微镜下观察染（100至400倍放大倍数）：激发波长365nm，散发波长425nm（类同DAPI滤波器）

真菌呈现丝状体蓝色荧光

 注意事项

• 本产品为20次操作
• 本产品可以检测各种真菌菌株，例如Alternaria alternata、Stemphylium botryosum、Cladosporium herbarum、Geotrichum candidum、 P. parasitica、Pyt. Aniderphermatum、Pyt. Ultimum、Fusarium oxysporum、Rhizopus stolonifer、Botrytis cinerea等
• 操作时须戴手套
• 操作时，严格无菌操作
•  碱性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全
• 染色时，避免光照
• 细胞染色前后的清洗过程中，小心操作
• 如果有酵母污染，可见较大的球体或椭球体（elliposoid）、发芽体蓝色荧光
• 如果为细胞碎片，通常可见不规则染色
• 本公司提供系列细胞培养污染检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰