真菌/酵母蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量检测试剂盒

 真菌/酵母蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

  真菌/酵母蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物酪蛋白受到蛋白酶水解，产生游离酪氨酸，与福林-酚反应，呈现蓝色产物的吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。其适用于各种细菌或酵母发酵产物以及上清样品蛋白酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

蛋白酶（protease）又称为肽酶（peptidase）或蛋白质酶（proteinase），是一类蛋白水解的酶，属于水解酶（hydrolase）家属中一员，存在于所有生物体内，共有560种不同的蛋白酶，通过易切断（sciccile）肽键的水解，进行蛋白质的分解代谢，参与细胞繁殖分化、免疫反应、神经外展、血管生成、血液凝结、补体系统、凋亡等一系列生理活动，同时水解食物蛋白、活化蛋白功能、产生信号分子、破坏蛋白结构。一旦失调，与感染性疾病、心血管疾病、退行性疾病、癌症等有关。蛋白酶基本分成6类，包括丝氨酸（serine）例如胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、凝血酶（thrombin）、纤溶酶（plasmin）、弹力蛋白酶（elastase）、枯草杆菌蛋白酶（Subtilisin）等；苏氨酸（threonine）、半胱氨酸（cysteine）例如胶原蛋白酶（collagenase）、蛋白酶K（proteinase K）、木瓜蛋白酶（papain）、胃蛋白酶（pepsin）、菠萝蛋白酶（bromelin）、无花果蛋白酶（ficin）、组织蛋白酶（cathepsin）等；谷氨酸（glutamate）、天冬氨酸（aspartate）、金属（metalloprotease）蛋白酶等；也可以分成酸性（例如嗜热菌蛋白酶Thermolysin）、中性和碱性蛋白酶等；还可以分成内切肽酶，例如胰蛋白酶（trypsin），和外切肽酶，例如羧基肽酶A（carboxypeptidase）。蛋白酶抑制剂成为抗病毒、凝血病、高血压的治疗药物。 基于底物酪蛋白（casein），在蛋白酶的催化水解下，释放出游离酪氨酸（tyrosine），继而与福林-酚试剂（Folin & Ciocalteus phenol）反应产生蓝色产物，通过其吸收峰值的变化（660nm波长），来定量分析蛋白酶的总活性。其反应系统为：

Protease

casein  +  H2O  →  tyrosine

tyrosin   +  Folin & Ciocalteus phenol   →  blue chromophore product

产品内容

  缓冲液（Reagent A）  50毫升

  底物液（Reagent B）  10毫升

  终止液（Reagent C）  50毫升

  中和液（Reagent D）     75毫升

  显色液（Reagent E）       15毫升

  补充液（Reagent F）  10毫升

  标准液（Reagent G）     5毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；  终止液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；  显色液（Reagent E），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

2.2毫升离心管：用于标准品操作的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品处理

培养箱：用于反应物孵育

比色皿：用于比色测定的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

• 移取5毫升新鲜的发酵样品到15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 分别移取上清液到预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

• 从-70℃取出待测样品，置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为660nm，并置零 
•   缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 标准样品测定

• 准备好5个2.2毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入1毫升  缓冲液（Reagent A）到2至5号管
• 移取2毫升  标准液（Reagent G）到1号管
• 小心移取1毫升1号管的  标准液（Reagent G）到2号管，混匀
• 小心移取1毫升2号管稀释的  标准液（Reagent G）到3号管，混匀
• 小心移取1毫升3号管稀释的  标准液（Reagent G）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

• 分别移取1毫升上述配制的系列  标准液（Reagent G）到15毫升锥形离心管
• 加入2.5毫升  中和液（Reagent D）
• 加入500微升  显色液（Reagent E），混匀
• 37℃温度下，孵育30分钟
• 转移到3毫升比色皿
• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
• 重复实验步骤8至14四次
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位；横座标（X轴）为标准酪氨酸浓度（毫摩尔/升）

• 样品和背景测定

• 移取2毫升  缓冲液（Reagent A）到新的15毫升锥形离心管
• 加入500微升  底物液（Reagent B）
• 加入500微升待测样品（100微克蛋白）或  补充液（Reagent F）
• 37℃温度下，孵育10分钟
• 分别加入2.5毫升  终止液（Reagent C），混匀
• 37℃温度下，孵育30分钟
• 移取1毫升上述反应产物到新的15毫升锥形离心管
• 加入2.5毫升  中和液（Reagent D）
• 加入500微升  显色液（Reagent E），混匀
• 37℃温度下，孵育30分钟
• 转移到3毫升比色皿
• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
• 实际样品吸光读数：样品吸光读数－背景吸光读数
• 根据标准曲线获得样品对应酪氨酸浓度（毫摩尔/升）
• 测算样品酶活性：

【根据标准曲线获得样品对应酪氨酸浓度（毫摩尔/升）X样品稀释倍数】÷10（反应时间；分钟）＝微摩尔酪氨酸/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔酪氨酸/毫克/分钟

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准样品测定
• 操作时，须戴手套
•   终止液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全
•   显色液（Reagent E）注意避光
• 样品检测前，须溶解和澄清
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 测定值由低到高变化，表明有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/500微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 蛋白酶活性单位浓度定义：在37℃室温下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的酪氨酸分子
• 本公司提供系列蛋白酶分析技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确