真菌/酵母角鲨烯合成酶活性光度法定量检测试剂盒中文版

真菌/酵母角鲨烯合成酶（squalene synthase）活性光度法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

 真菌/酵母角鲨烯合成酶（squalene synthase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用底物法尼基二磷酸，受到角鲨烯合成酶的催化过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值（NADPH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种真菌/酵母裂解悬液样品角鲨烯合成酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

角鲨烯合成酶（squalene synthase；EC2.5.1.21）是新（de novo）胆固醇生物合成通路中*步催化反应的酶蛋白，其包含二步反应，即通过催化2分子法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate；FPP））缩合反应，产生前体角鲨烯二磷酸（presqualene diphosphate；PSPP），继而在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的依赖性参与下，被还原为角鲨烯（squalene）。角鲨烯为三萜化合物（triterpenen），分子式C30H50，是植物、动物和人体中包括植物甾醇类（phytosterol）或胆固醇类生物合成的中间产物，广泛存在于动物和植物界，以及新生儿血液中，且用于化妆品、医药、疫苗、食物添加等，预防心血管疾病和癌症。角鲨烯合成酶是治疗低胆固醇血症（hypocholesterolemic）的药物靶标。 基于底物法尼基二磷酸，受到角鲨烯合成酶的催化，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析角鲨烯合成酶的活性。其反应系统为：

squalene synthase

2 FPP      →    PSPP  +  diphosphate

H⁺  +  NADPH   +  PSPP  → squalene  +  diphosphate  +  NADP⁺

产品内容

 裂解液（Reagent A）    10毫升

 强化液（Reagent B）   2毫升

 溶解液（Reagent C）   5毫升

 缓冲液（Reagent D）  20毫升

 反应液（Reagent E）       2毫升

 底物液（Reagent F）  2毫升

 阴性液（Reagent G）    1毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent A）、 缓冲液（Reagent D）、 反应液（Reagent E）和 底物液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

15毫升离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

超速离心机：用于样品操作

培养箱：用于孵育反应物

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管
• 置于冰槽里5分钟
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入250微升 裂解液（Reagent A），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 加入100微升 强化液（Reagent B）
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里1分钟
• 重复实验步骤9至10五次
• 加入250微升 裂解液（Reagent A），充分混匀
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为10000g 
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的超速离心管
• 放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升 溶解液（Reagent C），混匀颗粒群
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

• 准备好待测样品（例如微粒体样品等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
•  缓冲液（Reagent D）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取730微升 缓冲液（Reagent D）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent E）
• 加入100微升 底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里静置3分钟
• 加入50微升 阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 样品活性测定

• 移取730微升 缓冲液（Reagent D）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent E）
• 加入100微升 底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里静置3分钟
• 加入50微升待测样品（注意：50微克蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

或者

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品重量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10（反应时间，分钟）]＝单位/毫克 

单位＝微摩尔NADPH/分钟

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照测定
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
•  强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克  
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
• 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟
• 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟测定读数，表明有酶活性
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本微粒体蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； （本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 角鲨烯合成酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.4条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确