植物细胞色素P450亚酶71定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

植物细胞色素P450亚酶71（PSORALEN SYNTHASE；MARMESIN）活性

液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 植物细胞色素P450亚酶71（PSORALEN SYNTHASE；MARMESIN）活性液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒是一种旨在通过探针底物异紫花前胡内酯，受到P450-71的氧化作用，进而在液相色谱仪和紫外光谱下（312nm波长）检测分析其代谢产物，以定量测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物细胞或组织裂解萃取液样品、纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶CYP71的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞色素P450酶属于单加氧化酶（monooxygenase）一类的酶，其含亚铁血红素（heme），存在于所有生命系统内。在真核系统，为膜结合性，而原核生物，为胞浆蛋白。细胞色素P450酶共有15000种，植物细胞色素P450酶约有5000种。植物P450酶的作用在于体内内源化合物（endobiotics）和外源化合物（xenobiotics），包括除草剂（herbicides）、杀虫剂（pesticides）、杀真菌剂（fundicides）、污染物（pollutants）的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation），以达到解毒效果，同时合成次级代谢产物，例如酚类、膜性固醇、植物防御素（phytoallexin）、类萜（terpenoid），以及色素、复杂性大分子（例如角质cutin、木质素lignin、软木质suberin）和脂肪酸等。并在伤口愈合、抗虫害、抗微生物和真菌、以及信号传导中发挥重要作用。其中P450亚酶CYP71共有84种，占P450总量的20％，为zui大的植物P450家族。补骨脂素合成酶（Psoralen synthase）是细胞色素P450亚酶71的主要成员之一，包括大豆（soybean）71A9、A10、D8、D9、D10；茄子（Solanum melongena）A2、A4；总花猫薄荷（Nepeta racemosa）A5、A6；拟南芥A1等。基于底物异紫花前胡内酯（marmesin）在补骨脂素合成酶的催化下，转化为补骨脂素（psoralen），通过液相色谱仪和紫外光谱下（312nm波长）检测分析，来定量测定细胞色素P450亚酶71的活性。其反应系统为：

产品内容

 缓冲液（Reagent A）      毫升

 反应液（Reagent B） 微升

 底物液（Reagent C）      微升

 终止液（Reagent D）   毫升

 流相液（Reagent E）      毫升

 标准液（Reagent F）    微升

产品说明书    1份

保存方式

保存 缓冲液（Reagent A）、 反应液（Reagent B）、 底物液（Reagent C）和 标准液（Reagent F）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖； 终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品处理和标准液配制的容器

（微型）台式离心机：用于样品处理

恒温水槽或培养箱：用于样品反应孵育

液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

• 样品准备 

• 准备好待测样品，例如微粒体蛋白等
• 置于冰槽里融化

• 样品反应

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent A）到1.5毫升离心管
• 加入xx微升 反应液（Reagent B）
• 加入xx微升 底物液（Reagent C）
• 加入20微升待测样品（50微克微粒体蛋白）（注意：样品须清澈）
• 枪头抽吸混匀
• 在27℃温度下孵育60分钟
• 加入xx微升 终止液（Reagent D）
• 温和涡旋震荡5秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g
• 小心移取50微升上清液到新的1.5毫升离心管
• 放进浓缩离心机挥干
• 加入xx微升 流相液（Reagent E）
• 温和涡旋震荡10秒
• 即刻进行液相色谱分析（注意：如果暂时保存，建议在-20℃不超过3月）

三、测定准备

• 开启仪器预热15分钟
• 根据下表设置液相色谱仪（HPLC）参数

• 运行程序

• 标准样品配制

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入xx微升 流相液（Reagent E）到1至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent F）到1号管，混匀
• 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent F）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent F）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent F）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

五、色谱分析

• 将上述配制的 标准液（Reagent F）和待测样品放进冰槽里等待
• 每次（每个样品）注射100微升
• 按照检测运行程序每次（每个样品）运行35分钟
• 获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录

六、计算活性

1）样本补骨脂素浓度计算

2）样本酶活性计算

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准液
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，标准液测定只需1次
• 试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜
• 如果酶活性过低，可以增加反应时间至120分钟
•  终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全
• 建议使用 流相液（Reagent E）作为阴性对照或作为基准线
• 色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等
• 用户可以使用已知浓度的 标准液（Reagent F）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）
• 补骨脂素的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的 标准液（Reagent F）实际出峰为准
• 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为50微克/20微升 （本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 异紫花前胡内酯（S）和补骨脂素（P）HPLC的参考图谱如下：

• 细胞色素P450亚酶71单位活性定义为：在27℃，pH 7.0条件下，每分钟内能够产生1纳摩尔补骨脂素所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列毒理学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感