组织血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性荧光定量检测试剂盒

MB50309.2 v.A

 组织血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 组织血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底物马尿酰组氨酰亮氨酸，在血管紧张素Ⅰ转化酶1抑制剂的存在下，受到血管紧张素Ⅰ转化酶2的水解，释放出组氨酰亮氨酸，与非荧光性染料邻苯二甲醛反应产生高度荧光的二肽加合物后荧光峰值的变化，来测定组织裂解萃取样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体、昆虫等）血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，具有高通量、自动化操作的优点。

技术背景

血管紧张素Ⅰ转化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又称为肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基组织蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一种体细胞类150至180KD、生殖细胞类90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和锌金属肽酶（zinc metallopeptidase）。血管紧张素Ⅰ转化酶有2种同工酶：1型和2型，其间80至90%同源。I型主要存在于肺毛细管细胞内，也在血管内皮细胞、肾上皮细胞和睾丸leydig细胞膜中表达；II型主要存在于心脏和肾脏血管内皮细胞膜上。ACE在肾素-血管紧张素-醛固酮（aldosterone）系统中发挥重要作用。作为血管收缩剂（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管紧张素I的C末端的组胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切离水解反应，转化为血管紧张素II；同时作为血管扩张剂（vasodilator），ACE使缓激肽（bradykinin）失活。ACE常用于药物靶标，治疗高血压（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿灵furosemide）、糖尿病肾病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物N-马尿酰-L-组氨酰-L-亮氨酸（hippuryl-L-histidyl-L-leucine；HHL），在血管紧张素Ⅰ转化酶1抑制剂甲羟孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管紧张素Ⅰ转化酶2的水解，释放出组氨酰亮氨酸（L-histidyl-L-leucine；HL），与非荧光性染料邻苯二甲醛（o- phthaldialdehyde；OPA）反应，生成高度荧光的二肽加合物后荧光峰值的变化（激发波长360nm，散发波长485nm），来定量测定血管紧张素Ⅰ转化酶2的特异活性。血管紧张素Ⅰ转化酶2反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A）  毫升

 裂解液（Reagent B）  毫升

 缓冲液（Reagent C）  毫升

 底物液（Reagent D）    微升

 终止液（Reagent E）    毫升

 反应液（Reagent F）  微升

 中和液（Reagent G）    微升

 标准液（Reagent H）    微升

产品说明书   1份

保存方式

保存 底物液（Reagent D）、 反应液（Reagent F）和 标准液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 反应液（Reagent F）避免光照； 终止液（Reagent E）和 中和液（Reagent G）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器

超速离心管：用于样品离心的容器

台式离心机：用于样品沉淀

4℃超速离心机：用于分离膜蛋白成分

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

超声仪：用于裂解样品

培养箱：用于反应物孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。 反应液（Reagent F）避免光照。然后进行下列操作。

• 样品准备 

• 手术取出动物组织，并秤重以确定200至500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的xx至xx微升 裂解液（Reagent B） 
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下） 
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的超速离心管，转至步骤17
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），混匀沉淀颗粒
• 超声处理：200瓦，50%功率，5秒一次，间隔3分钟，重复2次——此步骤获得粗提总蛋白
• （选择步骤）放进上述超速离心管到4℃超速离心机离心30分钟，速度为40000g
• （选择步骤）小心移出上清液到到预冷的1.5毫升离心管——此步骤获得膜蛋白
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好上述待测样品，置于冰槽里
• 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长360nm，散发波长485nm，并设置增益倍数150至200
• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入xx微升 清理液（Reagent A）到1至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent H）到1号管，混匀
• 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent H）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent H）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent H）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 标准曲线测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升上述配制的 标准液（Reagent H）
• 加入xx微升 终止液（Reagent E），混匀
• 加入xx微升 反应液（Reagent F），混匀
• 室温下孵育10分钟，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混匀
• 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数
• 重复实验步骤1至7四次
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准组氨酰亮氨酸浓度（微摩尔/升）

• 样品测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 加入10微升待测样品（注意：50微克总蛋白或20微克膜蛋白） 
• 在37℃温度下孵育30分钟
• 加入xx微升 终止液（Reagent E），混匀
• 加入xx微升 反应液（Reagent F），混匀
• 室温下孵育10分钟，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混匀
• 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数
• 根据标准曲线获得样品对应组氨酰亮氨酸浓度（微摩尔/升）

• 计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔里
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）到待测样品孔里
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到标准样品孔里
• 分别加入10微升待测样品（50微克总蛋白或20微克膜蛋白）或上述制备的 标准液（Reagent H）到相应孔中里
• 在37℃温度下孵育30分钟
• 分别加入xx微升 终止液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板
• 分别加入xx微升 反应液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 室温下孵育10分钟，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混匀
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准组氨酰亮氨酸浓度（微摩尔/升）
• 根据标准曲线获得样品对应组氨酰亮氨酸浓度（微摩尔/升）
• 活性计算：

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 样品避免使用EDTA和EGTA等处理
• 建议样品保存在－70℃冰箱里 
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 测定值由低到高变化；测定可以持续30分钟 
• 荧光测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定30分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本为总蛋白，其浓度为50微克/10微升；待测样本为膜蛋白，其浓度为20微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果用户没有匹配的荧光滤波器，可以使用340至365nm激发波长和455至495nm散发波长的任一波长替代
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 标准曲线参考图像如下：计算公式为Y=19.748X + 10.585

• 样品中含有某种氨基肽酶，可能干扰检测，可以使用100微摩尔对氯汞苯甲酸（p-chloromercnribenzoate；PCMB）去除
• 可以使用血管紧张素Ⅰ转化酶2抑制剂DX600（IC50=10微摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
• 血管紧张素Ⅰ转化酶2单位活性定义为：在37℃，pH 8.3条件下，每小时内能够水解释放1微摩尔组氨酰亮氨酸所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列血管紧张素Ⅰ转化酶类检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感