上海铭博生物实验室介绍：细胞免疫治疗的监控细胞样本

上海铭博生物实验室介绍：细胞免疫治疗的监控细胞样本制备开始

一次完整的流式细胞分析包括：细胞样本制备，流式细胞仪操作和数据分析。细胞样品制备在流式分析过程中的重要性毋庸置疑，直接影响数据的准确度及实验的整体进展。然而传统细胞样本制备过程中，离心可能对细胞造成诸多缺陷，例如：对细胞造成挤压和破坏；不可控的细胞丢失使得原始样本中的细胞群比列产生偏差，导致数据严重失真，让研究者可能得到不客观的数据分析和诊断结果，此外，传统离心法还显著受到操作者差异性的影响，并且需要消耗大量的人力和物力。

因此，想要获得更加科学的实验数据，迈入可定量、可重复性的流式细胞分析新境界，提升细胞制备过程是关键所在。

DA-Cell微滴阵列样品前处理系统作为新一代样品前处理系统，利用重力与层流的效应，可以在不用离心的情况下用非常轻柔和科学的方式实现对细胞，微珠等悬浮样品的清洗操作。其在细胞制备过程中展现出来的优势，是目前传统离心方法所*的。
                 
Adicet Bio是一家专注于细胞免疫治疗研发的公司，在 2016年与再生元(Regeneron Pharmaceuticals)签订了一项长达5年的合作协议，旨在实体肿瘤和血液肿瘤等多个项目开展合作(包括同种异体细胞疗法)。为了能够接合并杀死肿瘤细胞，Adicet Bio正在开发基于γδT细胞的工程化嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)，以特异性靶向细胞内外抗原，为多种血液肿瘤和实体肿瘤提供多元化的临床候选产品。

γδT细胞(ICP)产品在体外制备过程包括以下步骤：
1. 从健康捐赠者身上分离提取γδT细胞
2. 对γδT细胞进行基因改造
3. γδT细胞扩增
4. 扩增后的γδT细胞产品存入细胞银行，以备后续使用

图1. γδT细胞产品体外制备流程

Adicet Bio公司于第2, 3, 4步骤采用基于流式细胞术的分选方案对不同的捐赠者进行样本选择和质控，以确保后续用于治疗的产品符合要求。γδT在人体血液中的含量非常低，如果在样本制备过程中捐赠者的细胞丢失严重，可能会导致研究人员对结果误判。为了避免这种情况，并获取到更真实和科学的流式数据，挑选到合适的样本，Adicet Bio公司研究人员在分选方案的细胞样本制备过程中使用了DA-Cell微滴阵列样品前处理系统。

图2.  捐赠者的样本含有不同比例的γδT细胞

图3. 基于流式细胞术的样本分选方案

结果一：DA-Cell可提升流式数据质量
高质量的流式细胞数据可以帮助研究人员正确分选捐赠者样本和质控，减少因假阳性结果产生的误判。



结果二：DA-Cell使实验重复性高
DA-Cell自动化程度高，避免了人工操作的误差，极大的提升了实验的可重复性，即使样本稀有，也可获得较高的重复性。



结果三：：DA-Cell的数据稳定性程度高
细胞样本无论经过DA-Cell几次处理，细胞亚群的比例保持一致，避免数据出现偏差。



结果四：DA-Cell节省大量时间
DA-Cell 自动化程度高，仅需要传统离心方法的10-20%的时间，从而提升实验效率。


总结

DA-Cell 微滴阵列样品前处理系统了传统的离心方式，其原理是利用重力和流体力学的层流效应，在非离心的情况下，用非常轻柔和科学的方式实现对细胞、微珠等悬浮样品的清洗操作。与传统的离心方式下相比，DA-Cell 展现了巨大的优势：

1. 杜绝因传统离心法造成的数据偏差、得到更加科学的结果
由于不同细胞的大小、密度、形态等各不相同，它们在传统离心法处理过程中丢失的比例各不相同，保留的比例已经偏离原始的真实值，会导致结果的偏差、甚至错误。而 DA-Cell 方法细胞丢失很少，可地保留原始的细胞比例，有助于得到更加真实、科学的结果。


△   传统离⼼法只保留20-30%细胞样品，DA-Cell可保留95%以上的细胞样品
△   相较传统离⼼⽅式，DA-Cell可呈现更强的荧光讯号与完整细胞形态
△   离⼼过程对细胞所造成的挤压会严重影响细胞的⽣理功能与蛋⽩表达


2. 节省时间、提升效率和通量



传统离心与DA-Cell方法制备细胞样本流程比较

传统离心法每次清洗都有多个步骤，包括：加液、重悬、离心、去上清等，如果清洗 2-4 次就需要 20-40 分钟，而 DA-Cell 方法则仅需要 2-6 分钟，仅需要传统方法10-20%的时间。

3. 样品处理过程非常温和，杜绝压力和细胞破损

传统细胞、微珠等悬浮样品的制备都必须通过离心，离心力达到数百 g 或数千 g（即细胞需要承受相当于自身重量的数百或数千倍的压力），这对细胞状态的影响极大，甚至产生破碎；而 DA-Cell 仅利用细胞自身的重力和流体力学的层流效应既可以实现对样品的制备过程，对细胞没有任何胁迫，所以可以显著减少细胞破损。


△   比较PBMC样品经过4X的DA-Cell处理 vs 4X的离心处理对细胞活率的影响
△   DA-Cell在活细胞的比率上显著高过传统离心法
△   数据显示传统离心法相较DA-Cell容易造成更多的细胞损伤，甚至细胞死亡

4. 减少细胞胁迫、保持原始的蛋白和生物标志物表达水平
减少细胞胁迫、保持原始的蛋白和生物标志物表达水平传统离心的方式会对细胞等悬浮样品产品大量胁迫，这会影响很多基因的表达水平，并终很可能影响科学家所要观察的蛋白和生物标志物，从而产生有偏差的数据。DA-Cell 微滴阵列样品前处理系统对细胞的压力和干扰很小，可以降低对蛋白和生物标志物表达水平的干扰。

△   数值为正数代表染色指数较高，使用DA-Cell后，蛋白染色度相对增加
△   有效观测蛋白和生物标志物，实验结果更加直观

5. 提升流式分析数据结果
DA-Cel可以在不用离心的情况下用非常轻柔和科学的方式实现对细胞进行清洗，所获得的数据即使进行多色流式分析，也可以轻易得到可靠的细胞分群结果。


样品分别在传统离心法与DA-Cell处理过后，在16色荧光流式分析的比较
△   HSC/iNKT ：DA-Cell因可减少细胞与讯号的丢失，可让实验者看到稀有细胞亚群，传统离⼼法则无
△   GDT/MAIT：DA-Cell可显著的提升细胞亚群间界线，传统离⼼法就因过多细胞碎⽚易造成区分困难

6. 全自动操作、更好的可重复性、避免人工导入的偏差

传统离心法的人工因素很多，由于不同人的操作手法不一样、同一个人在不同时间的操作手法也难以保持一致，因此实验可重复性较差；而 DA-Cell 是全自动操作，避免人工导入的误差，可极大提升实验的可重复性。

魔鬼藏在细节里，细节决定成败，DA-Cell可在细胞处理的细节上改善数据的质量，使流式细胞分析迈入可定量，可重复性的新境界，从而提升细胞免疫治疗的监控，