细胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-s

 细胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶连续循环光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶连续循环光谱法定量检测试剂是一种旨在使用胱硫醚-β-合成酶、赖氨酸脱羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶连续循环法反应系统中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物和人体细胞裂解悬液等胱硫醚-β-合成酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS；EC4.2.1.22），又称为β-硫解酶（β-thiolase）或半胱氨酸合成酶（cysteine synthase），属于水解酶（hydrolyase）家属中的一员，作用于硫代谢中转硫通路（transsulfuration pathway）或胱氨酸（cysteine）代谢的*步。在辅因子磷酸吡哆醛（Pyridoxal Phosphate）和S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine；adoMet）的帮助下，催化将同型胱氨酸（homocysteine）转化为胱硫醚（cystathionine）的反应。人体胱硫醚-β-合成酶为四体蛋白，551氨基酸。但心脏、肺、睾丸、脾脏不具有胱硫醚-β-合成酶活性。其基因突变引起胱硫醚-β-合成酶缺失，将导致高胱氨酸尿症（homocystinuria），一种高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia；HHC）；而胱硫醚-β-合成酶异常高度表达，为唐氏综合症的特征之一。 基于底物丝氨酸（serine）和半胱氨（cysteamine）， 受到胱硫醚-β-合成酶的水解，进而通过赖氨酸脱羧酶（Lysine decarboxylase；LDC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase；PEPC）和苹果酸酸脱氢酶（malate dehydrogenase；MDH）反应系统中，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所产生的峰值变化（340nm），来定量分析胱硫醚-β-合成酶的活性。其反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B）      毫升

 缓冲液（Reagent C） 毫升

 酶促液（Reagent D）      微升

 反应液（Reagent E）      微升

 底物液（Reagent F） 微升

 阴性液（Reagent G）   微升

产品说明书    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

微型台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于反应孵育

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光谱分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent F）注意避光； 缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

• 准备好上述待测样品，置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升 阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 样品活性测定

• 移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里静置3分钟
• 加入10微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分别加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升 反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升 阴性液（Reagent G）或待测样品（100微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和10分钟读数
• 活性计算

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 建议样品忌用碳酸盐处理
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
• 反应测定值由高到低变化；测定可以持续10分钟
• 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟测定读数，表明有酶活性
• 光谱测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 胱硫醚-β-合成酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 8.0条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列转硫通路类酶学技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确