细菌呼吸链复合物4活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
细菌呼吸链复合物4活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低,即采用比色法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌裂解悬液呼吸链复合物IV的活性检测。产品严格无菌,即到即用,活体检测,操作简捷,性能稳定。
技术背景
细菌呼吸链复合物IV (Bacterial Complex IV),又称为细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase;EC1.9.3.1)或细胞色素bc1 复合物(Cytochrome bc 1 complex),存在于细菌细胞膜上,为呼吸脸上的终端酶,属于含血红素/铜终端氧化酶超级家族成员之一,与真核细胞线粒体复合物IV的核心结构类似,含有I至III保留的核心亚体,细菌共有4个亚体,而线粒体共有13个亚体。在细菌有氧生长环境中,复合物IV为诱导性,主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C(reduced cytochrome c),受到呼吸链复合物IV的催化,转化为氧化型细胞色素C(oxidized cytochrome c),在分光光度仪下,出现吸光值的变化(550nm 波长),由此定量测定呼吸链复合物IV的活性。呼吸链复合物IV反应系统为:
产品内容
缓冲液(Reagent A) 毫升
反应液(Reagent B) 毫升
稀释液(Reagent C) 毫升
稳定液A(Reagent D1) 管
稳定液B(Reagent D2) 微升
产品说明书 1份
保存方式
缓冲液(Reagent A)和 稀释液(Reagent C)保存在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里; 反应液(Reagent B)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于反应液配制的容器
比色皿:用于比色的容器
分光光度仪:用于比色分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的 稳定液B(Reagent D2)置入冰槽里融化,然后移出xx微升到 稳定液A(Reagent D1)管里,混匀后,标记为 稳定工作液,置于冰槽里备用(注意,用完后即刻放回-20℃冰箱里)。然后将-20℃冰箱里的试剂盒中的 反应液(Reagent B)置入冰槽里融化;然后移出100微升到新的1.5毫升离心管,加入xx微升 稳定工作液,轻柔混匀后,室温下避光静置15分钟(可见颜色变化),置于冰槽里,标记为 反应工作液(注意:见注意事项4),放在暗室里。然后进行下列操作。
一、 测读准备
1. 准备好含有复合物IV的样品,置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪:温度25℃,波长550nm,间隔10秒,测读7次(共60秒),并置零或设置0秒和60秒各测读1次
3. 缓冲液(Reagent A)室温下均衡温度
二、 背景对照测定
1. 移取xx微升 缓冲液(Reagent A)到新的1毫升比色皿
2. 加入xx微升 稀释液(Reagent C)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 室温下孵育3分钟
5. 加入xx微升含有 反应液(Reagent B)和 稳定液(Reagent D)的 反应工作液
6. 上下倾倒数次,混匀
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0秒读数-60秒读数),正常读数差值为0.001至0.005
三、 样品测定
1. 移取xx微升 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入100微升待测样品(注意:建议总量50微克细菌蛋白)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 室温下孵育3分钟
5. 加入xx微升含有 反应液(Reagent B)和 稳定液(Reagent D)的 反应工作液
6. 即刻上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0秒读数-60秒读数),通常活性读数差值为正数
四、 计算样品活性
注意事项
1. 本产品为20次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 线粒体样品中忌用DTT和巯基乙醇等处理
4. 每增加1个样品,增加 反应工作液为: 反应液(Reagent B)100微升+ 稳定工作液3微升,以此类推。配制反应工作液时,须根据样本数量配制实际工作液容量
5. 系统操作过程中,背景测定只需1次
6. 分光光度计波长严格设置在550nm,误差10nm将不产生信号
7. 加样后3秒内进行比色测定
8. 比色测定后,比色皿须清洗*
9. 比色皿背景空对照0秒读数通常大于0.2为理想状态;建议使用比色皿测定
10. 背景空对照的正常读数差值(0秒-60秒)通常为0.001至0.005(正负即可)
11. 样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
12. 样本测定60秒读数低于0秒读数表明具有酶活性
13. 线粒体呼吸链复合物IV酶活性单位浓度定义:在25℃室温下,pH 8.0的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)氧化1微摩尔的细胞色素C
14. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1)
15. 本公司提供系列细菌复合物研究产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感