50270.1 v.A
细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）活性比色法定量检测试剂盒
产品说明书（中文版）
主要用途
细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解，释放黄色对硝基苯胺，产生吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体等）尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又称为尿激酶（urokinase；UK），属于丝氨酸蛋白酶，存在于血液、细胞外基质和尿液中。尿激酶由411氨基酸构成，分子量为54KD，有3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域、kringle结构域和生长因子结构域。其主要的生理性底物为纤维蛋白溶酶原（Plasminogen），即纤维蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切离部位为Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切离后激活，纤维蛋白溶酶参与细胞蛋白水解过程，包括血栓溶解（thrombolysis）和细胞外基质降解等。uPA与组织重构、修复、血管形成（angiogenesis）性疾病和肿瘤扩散有关。uPA的抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），即纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺）受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的活性。其反应系统为：
uPA
p-EGR-pNA-HCl → p-EGR-OH + pNA
（黄色）
产品内容
清理液（Reagent A） 120毫升
裂解液（Reagent B） 10毫升
缓冲液（Reagent C） 2毫升
阴性液（Reagent D） 1毫升
底物液（Reagent E） 220微升
产品说明书 1份
保存方式
保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
微型台式离心机：用于样品沉淀
培养箱：用于反应物孵育
96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于样品比色测定的容器
酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后进行下列操作。
一、 样品制备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入200至500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好上述制备的待测样品
2． 设定好分光光度仪或酶标仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零
三、 活性测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取85微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3． 分别加入5微升 阴性液（Reagent D）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
4． 分别加入10微升 底物液（Reagent E）
5． 轻轻摇动96孔板（注意：避免气泡）
6． 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
7． 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
8． 活性计算：
（1） 酶标仪检测
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 10.5（毫摩尔吸光系数）X 60（反应时间；分钟）X 0.3（光径距离；厘米）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔对硝基苯酚/分钟
（2） 比色皿检测
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 10.5（毫摩尔吸光系数）X 60（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔对硝基苯酚/分钟
注意事项
1． 本产品为21次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品须澄清，且避免反复冻融
5． 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
6． 比色测定后，比色皿须清洗*
7． 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
8． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升；如果样本酶活性过低，则可以延长反应孵育时间至16小时；其次增加样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
10． 尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂单位活性定义为：在37℃，pH 7..5条件下，每分钟内能够切离1微摩尔三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作为一个活性单位
11． 本公司提供系列细胞蛋白酶学检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
